一．骨关节炎膝关节软骨退变疾病背景：

膝关节骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种最常见的慢性、进行性关节疾病，其本质是整个关节器官的病变，核心特征是关节软骨的进行性磨损、破坏和丢失，并伴随软骨下骨硬化、关节边缘骨赘（俗称骨刺）形成、滑膜炎症、韧带松弛以及半月板退变等一系列病理改变。该病的根本病理生理机制是关节软骨的分解代谢与合成代谢失衡，促炎细胞因子（如IL-1β、TNF-α）和基质降解酶（如MMP-13）的过度表达，导致软骨细胞外基质中的II型胶原和蛋白聚糖等关键成分降解加速，而软骨细胞的修复能力则随之下降。

其临床症状通常隐匿出现并逐渐加重，主要包括活动后加重的关节疼痛（尤其是“启动痛”）、晨僵（通常持续时间小于30分钟）、关节活动范围减小、活动时有摩擦感（音），晚期可出现关节畸形（如内翻或外翻）和功能严重受限。主要风险因素包括不可改变的年龄增长、女性绝经后状态、遗传易感性，以及可改变的肥胖（增加机械负荷和系统性炎症）、关节损伤史、过度使用和股四头肌肌力减弱等。

诊断主要依据临床表现和影像学检查（X线显示关节间隙不对称狭窄、骨赘形成、软骨下骨硬化和囊性变），治疗目标是缓解疼痛、改善功能、延缓疾病进展，采取阶梯化策略，从基础的生活方式干预（减重、运动疗法）、物理治疗、药物治疗（口服/外用NSAIDs、关节腔注射皮质类固醇或透明质酸），到最后的手术治疗（关节镜下清理术、截骨术、人工关节置换术）。近年来，针对其炎症及代谢机制的生物制剂和干细胞疗法等新兴治疗策略也成为研究热点。

二．单细胞测序联合空间转录组平台：

2.1 单细胞测序：

单细胞全基因组测序技术，是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行无偏扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。

随着单细胞RNA测序技术应用的持续火热，目前出现了一些大规模单细胞测序平台，可以快速、大量的制备单细胞转录组文库并用于下游测序。目前主要的平台包括：10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution、BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System、C1™ 单细胞全自动制备系统、Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution、ICELL8 Single-Cell System等。

0x Chromium Single Cell Gene Expression Solution由10x genomic公司于2016年2月推出，可实现大量细胞的快速高效标记、测序和分析，获得单细胞水平的基因表达谱和差异情况，并通过对复杂细胞群体进行深入细致分析，绘制大规模单细胞表达图谱。

该平台技术原理类似于Drop-seq：10x genomics平台首先利用微流控技术分选单个细胞，然后将带有barcode和引物的凝胶珠以及单个细胞包裹在油滴中；在油滴中凝胶珠溶解释放反转录oligo，细胞裂解释放mRNA，通过SMART法获得用于测序的带barcode的cDNA；液体油层破坏后，cDNA进行后续文库构建，使用Illumina测序平台检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，10mins内自动完成多至80,000个细胞的捕获。

2.2 空间转录组：

空间转录组技术是一种高通量的方法，旨在同时检测生物样本中大量基因的转录水平以及这些基因在特定组织或器官内的空间分布模式。这种技术通过结合分子生物学和成像技术，为研究人员提供了前所未有的视角，使他们能够深入了解基因表达如何在不同细胞类型和组织微环境中产生差异。基本原理：

（1）样本制备：首先，从感兴趣的生物体中获取组织样本，并进行适当的处理以保持其结构和分子完整性。这通常涉及切片、固定和渗透等步骤。

（2）捕获转录本：利用特定的捕获技术（如基于寡核苷酸探针的捕获系统），将组织中的mRNA或其他类型的RNA分子捕获到阵列上或测序平台上。这些捕获技术可以确保每个位置上的RNA都与其在组织中的原始位置相对应。

（3）测序与分析：接下来，对捕获到的RNA进行测序，以生成大量的序列数据。这些数据随后被用于分析基因的表达水平和它们在不同组织区域中的分布情况。通过先进的计算方法和可视化工具，研究人员可以构建出基因表达的“空间图谱”，从而揭示基因表达的空间异质性。

菩禾生物与东南大学生物科学与医学工程学院联合推出基于芯片法的空间转录组技术，可扩展至全长转录组的检测，助力非编码RNA的调控研究。详细资料可后台回复获取。

三．骨关节炎膝关节软骨退变中运用单细胞测序联合空间转录组平台的应用场景

Unveiling inflammatory and prehypertrophic cell populations as key contributors to knee cartilage degeneration in osteoarthritis using multi- omics data integration

期刊：Osteoarthritis  发表时间：23 January 2024   影响因子：20.6

3.1 研究背景：

关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种高发性、年龄相关的异质性关节疾病，主要特征包括关节软骨退变、软骨钙化、软骨下骨硬化及炎症反应。传统观点认为软骨主要由单一类型的软骨细胞构成，但近年研究发现软骨细胞具有高度异质性。尽管已有多种组学研究（如基因组、转录组、表观基因组和蛋白质组）揭示了OA相关的遗传变异、差异表达基因和潜在生物标志物，但这些研究多基于群体平均水平，忽略了细胞水平的异质性。

近年来，单细胞测序技术和空间转录组技术的发展为解析软骨细胞的异质性及其在空间结构中的分布提供了可能。然而，目前仍缺乏对膝关节软骨细胞在单细胞和空间水平上的系统性转录组图谱，尤其是在OA发病过程中关键细胞亚群的作用及其分子机制尚不明确。

3.2 研究方法：

本研究采用多组学数据整合分析策略，结合以下技术和方法：

• 单细胞RNA测序（scRNA-seq）

使用10x Genomics平台对来自8名OA患者和3名非OA对照的11个软骨样本进行测序，共分析135,896个软骨细胞。

通过Harmony、Seurat和LIGER等方法整合多个样本数据，识别细胞亚群。

• 空间转录组分析（Geo-seq）

使用激光捕获显微切割结合全长mRNA测序技术，对来自4名OA患者和1名对照的124个样本点进行分析。

将软骨分为四个区域：关节表面（AS）、表层（SZ）、中层（MZ）和深层（DZ），研究基因表达的空间分布。

• 生物信息学与统计分析方法

细胞注释与标记基因鉴定：基于差异表达分析鉴定33个标记基因，用于定义11个软骨细胞亚群。

轨迹推断：使用Monocle2推断软骨细胞分化轨迹。

细胞间通讯分析：使用CellChat识别配体-受体相互作用。

去卷积分析：使用CIBERSORTx将bulk RNA-seq数据反卷积为细胞组成。

GWAS整合分析：使用CELLECT将scRNA-seq数据与GWAS汇总数据结合，识别与OA遗传风险相关的细胞类型。

• 实验验证

免疫组化（IHC）：验证标记基因（如BMP2、IBSP、IFI27、CD74等）在软骨组织中的表达与定位。

qRT-PCR：验证关键基因（如MIF、CD74、IL-1β、TNF）在OA软骨中的表达变化。

过表达实验：在C28/12软骨细胞系中过表达CD74，验证其促炎作用。

3.3 实验方案设计：

3.4 主要研究结果：

3.4.1 单细胞测序部分的主要结论

（1）发现了新的软骨细胞亚群：

炎症前软骨细胞：一种新的软骨细胞亚型，表达 IFI16 和 IFI27 等基因。

炎症性软骨细胞：另一种新的软骨细胞亚型，特异性高表达 CD74、CXCL8 和 GPR183 等经典免疫相关基因。这两个新亚群几乎只存在于OA患者的软骨中，是OA病理状态的特有特征。

（2）构建了最全面的软骨细胞图谱：

共定义了11个软骨细胞群体，并鉴定出33个高特异性标记基因。这套标记基因能准确注释不同平台和技术产生的软骨单细胞数据，解决了以往研究标记基因不一致的问题。

（3）揭示了OA的关键致病细胞群体：

前肥大软骨细胞：在OA患者中比例显著升高，是OA与非OA之间组成差异最显著的群体。

前纤维软骨细胞：是对患者进行分子分型的主要贡献者。其丰度高低可将OA患者分为不同的亚型。

描绘了细胞的发育轨迹：轨迹分析显示，preInfC和InfC位于分化路径的末端，表明软骨细胞在OA晚期会向具有炎症和纤维化特征的终末状态分化。

3.4.2 空间转录组部分的主要结论

（1）明确了关键细胞群体的空间定位：

前肥大软骨细胞：在OA样本中，主要富集在关节表面；而在健康样本中，则主要位于深层区域。这种空间分布的改变提示其在OA发病中扮演重要角色。

炎症性软骨细胞：特异性地存在于OA样本的中层区域，在健康软骨中完全缺失。

前纤维软骨细胞：在负重区的关节表面和浅层比例显著低于非负重区，提示其可能具有保护作用，而其在负重区的缺失与疾病相关。

（2）确定了OA的活跃病变区域：

关节表面和浅层区域是OA中基因表达变化最剧烈、最活跃的区域。大多数OA相关的差异表达基因都集中在这两个区域。

中层和深层区域的基因表达变化则缺乏有意义的生物学通路富集，相对“静止”。

（3）揭示了区域特异性的生物学过程：

OA的关节表面富集了免疫炎症反应相关通路。

OA的浅层区域则富集了细胞周期和转录调控相关通路，表明该区域的细胞试图通过增殖来修复AS的损伤。

敬请注意：本文仅供相关专业人员学习参考之用，文中的所有信息均不作为诊断和治疗疾病的依据。如出现文中描述的症状，请及时就医。另外，本文仅节选原文的一部分，内容可能不完整或与原文存在偏差，若需更完整的信息请参阅原文。