LCMomics 空间多组学技术平台
平台介绍：
L CMomics 是基于激光显微切割（Laser CaptureMicrodissection，LCM）的空间多组学（omics）方案：针对组织空间中特定的细胞群、单细胞或亚细胞，利用激光显微切割技术将目标细胞进行分选，分选之后的细胞进行基因组、转录组和蛋白质组等组学测量和数据分析。该技术平台已成功应用于癌症、干细胞、神经科学、生殖、发育生物学、类器官、植物和海洋生物等领域。
LCMomics 空间多组学技术流程：
一、精准捕获细胞的 “微观手术刀”——激光显微切割技术（Laser Capture Microdissection, LCM）：
激光捕获显微切割（LCM）技术整合了红外捕获激光与紫外切割激光的优势：红外激光可在温和条件下 “抓取” 目标细胞，最大程度保留核酸、蛋白质等生物分子的完整性；紫外激光则能快速、精准地切割致密或复杂组织，实现对单个细胞、细胞群甚至特定组织区域（如肿瘤浸润前沿、癌巢）的分离。该技术的核心优势在于空间分辨率高（可定位切割低至20μm 区域）、样本兼容性广（支持各种切片、涂片样本）、下游分析灵活（可衔接RNA 测序（RNA-seq）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、下一代测序（NGS）、蛋白质组学等多种技术），完美解决了传统“bulk 分析” 无法区分细胞来源、掩盖细胞异质性的问题。当与特征明确的表型标记（如抗体）相结合时，该方法可以精确提供深度的、空间定义的和细胞类型指导的多组学分析。LCM技术的出现，打破了传统研究中 “批量分析混合细胞” 的局限，能在显微镜下精准捕获单个细胞或特定细胞亚群，为深入探索疾病异质性、分子分型及预后机制提供了强有力的工具。
二、LCMomics 空间多组学技术平台的应用场景
（一）LCMomics：空间基因组——食管癌早期病变与食管癌演化特征[1]
研究背景
癌细胞的出现往往经历长时间的癌前演变，研究正常细胞到癌前病变，再到癌细胞的基因组演化过程，对于理解癌症发展机制，发展癌症早期诊疗手段，都具有重大意义。LCMomics空间基因组技术为解析癌细胞的基因组演变提供了必要的手段。
研究方法：
收集45例ESCC患者的不典型增生和癌组织样本（TD队列），13例无ESCC患者的不典型增生样本（NTD队列）。经激光捕获显微切割分离正常食管上皮细胞、低级别不典型增生，高级别不典型增生和癌细胞，分别进行全外显子测序和低深度全基因组测序，分析体细胞突变、拷贝数变异（CNAs）等，构建系统进化树评估克隆关系。
实验方案设计：
主要研究结果：
突变负荷相似：TD队列中，高级别不典型增生（HD）的突变负荷与ESCC相近，低级别不典型增生（LD）较低；NTD队列突变负荷显著低于TD队列。ESCC和不典型增生样本都有大量的C>T转换。
突变景观相似：ESCC相关驱动基因在不典型增生样本中高频出现，如TP53突变在不典型增生样本中频率达95.6% ，表明其在ESCC进展中发生较早。
样本间异质性明显：TD队列中，不典型增生与ESCC样本间异质性高，不典型增生样本亚克隆突变多。如患者P1中，不同不典型增生样本与ESCC样本的突变重叠少。
拷贝数变异（CNAs）出现早：ESCC发展早期存在CNAs，且在不典型增生和ESCC样本中模式相似。常见的CNAs包括3q、5p等区域的扩增和3p等区域的缺失，3q扩增可能在恶性转化初期出现。
TP53“双打击”失活是关键事件：TP53突变倾向于作为主干突变，TD队列中多数不典型增生和ESCC样本存在TP53突变且伴有杂合性缺失（LOH），而NTD队列中少见，提示TP53完全失活对ESCC发展至关重要。
图1：所有样本的突变密度和背景
图2：突变景观
图3：典型病例的体细胞突变区域分布和系统发育树
（二）LCMomics：空间基因组——3D基因组图谱揭示人类胰腺癌前病变的多灶性[2]
研究背景：
胰腺上皮内瘤变(PanIN)是胰腺癌（尤其是胰腺导管腺癌，PDAC）最常见的前体，其体积小且在人体内难以接近，无法肉眼识别，研究起来具有很大困难。传统的2D组织学切片方法无法全面了解PanIN的数量、尺寸、形状及其在组织内的连通性，无法深入了解早期癌症的发展。
研究方法：
通过分析46个大体正常的人胰腺大块样本(从宏观上看似乎是健康的，没有发现明显的癌变或其他疾病病变)，使用机器学习流程CODA，在单细胞分辨率下进行定量3D组织学重建，了解PanIN的数量、尺寸、形状及其在组织内的连通性。作者开发了一种3D建模工作流程，指导多区域显微切割以及靶向和全外显子组测序，阐明PanIN之间和内部的遗传异质性。
实验方案设计：
主要研究结果：
平均每立方厘米有13个PanIN，推测一个正常成人胰腺中可能含有数百个PanIN，几乎全部具有致癌KRAS突变。
大多数PanIN起源于具有不同体细胞突变谱的独立克隆。
某些空间连续的PanIN含有多个KRAS突变，不同的KRAS突变定位在这些肿瘤内的不同细胞亚群，表明这些细胞亚群是多克隆起源。
体细胞突变，包括KRAS基因的热点突变、CDKN2A和TP53等肿瘤抑制基因的失活突变，驱动了PanIN的发生和发展。
图1. CODA 3D建模和测序的组织处理工作流程以及样本队列
图2.3D建模技术量化PanINs微观解剖特征
图3.三维建模结合下一代测序技术深入分析特定胰腺组织样本PanINs
（三）LCMomics：空间转录组——激光显微切割系统助力解释小鼠行为模式的神经机制[3]
研究背景：
多巴胺是奖赏动机的重要神经机制。伏隔核（NAc）与腹侧被盖区（VTA）形成相互连接，可以直接和间接的方式调节多巴胺神经元的活动。NAc神经环路功能变化是奖赏学习的重要神经基础，而NAc功能障碍与抑郁症和药物成瘾等脑疾病有密切关系。研究表明，伏隔核的内外侧亚区（NAcLat和NAcMed）中的神经元在动机行为中扮演着相反的角色，对奖赏刺激的反应、接受输入的大脑区域以及转录谱均不同。
研究方法：
研究人员使用体内单细胞分辨率钙成像，发现NAc的内侧和外侧壳亚区（NAcMed，NAcLat）中存在不同的奖励编码模式。奖励消耗（Reward consumption）会增加NAcLat活性，但会降低NAcMed活性。通过进行位置特异性RNA-SEQ（Geo-SEQ），揭示了与NAcMed和NAcLat突触形成和功能相关的基因在空间上的不同表达模式。空间转录分析还表明，神经降压素(NTS)标记了一组NAcLat神经元，可卡因和苯丙胺调节的转录蛋白(Cartpt)标记了一组NAcMed神经元，为未来在生理和病理条件下对NAc亚区的遗传解剖提供了一个框架。
实验方案设计：
主要研究结果：
揭示大脑伏隔核不同亚区的奖赏编码特征。
微型显微钙成像和环路示踪技术，研究人员发现NAc神经元对奖赏的反应存在巨大的异质。
利用空间转录组测序技术，揭示了NAcLat 和NAcMed在转录组水平上的巨大差异，并鉴定了Nts-阳性的神经元作为NAcLat的代表和Cartpt-阳性的神经元作为NAcMe的代表。
提供了对NAc功能更全面的理解，并将有助于未来开发治疗奖赏相关疾病（如药物成瘾和抑郁症）的新型治疗策略。
图1 NAcLat和NAcMed的不同转录图谱
图2 在NAcLat和NAcMed中，不同的输入可能有助于奖励联想学习期间的神经元活动
（四）LCMomics：空间转录组——内脏痛和躯体痛特异性识别传导的神经和分子机制[4]
研究背景：
疼痛是一种不愉快的感觉，被称为“第五大生命体征”，是机体自我防御的一种反应。近年来，人们对大脑高级中枢调节疼痛的神经环路和分子机制的认识取得了重大突破。然而，大脑特异性处理来自身体不同部位的痛觉信息并产生不同感觉和行为的具体机制仍未阐明。从位置上划分，疼痛有两个主要来源：内脏和躯体。内脏疼痛和躯体疼痛有密切的联系，并受到多个相同脑区的调控，但两者本质上是两种不同的痛觉形式。由于内脏和躯体的痛觉信息在大脑中被特异性识别编码的机制不明，目前临床上多数的镇痛药物和治疗手段无疼痛类型靶向性，对机体有较大的副作用。因此，探讨特异性识别传导内脏疼痛和躯体疼痛神经分子机制迫在眉睫。
研究方法：
为了研究PVH在内脏痛和躯体痛中的反应，研究人员使用Tet-off病毒系统并结合c-Fos染色来研究PVH中由内脏痛和躯体痛激活的神经群体。通过结直肠扩张（CRD）构建小鼠的内脏痛模型，通过机械刺激（VFF）构建小鼠的躯体痛模型。对CRD和VFF分别激活的PVH神经元（表达mCherry的红色荧光神经元和c-Fos染色的绿色荧光神经元）进行分析，发现，大约40.68%的PVH神经群仅对内脏痛有反应，36.65%仅对躯体痛有反应，而23.67%对两者都有反应。提示PVH脑区存在不同的神经亚群，它们分别特异性处理内脏痛和躯体痛信号。
主要研究结果：
该研究提出下丘脑室旁核（PVH）作为“疼痛分拣中心”分别处理内脏痛和躯体痛信号。
PVH中由内脏痛和躯体痛激活的神经元集群虽存在少量重叠，但主要呈现相互独立的特征，并分别投射至外侧隔核腹侧部分（LSV）和未定带尾侧部分（ZIC），专门介导内脏痛与躯体痛。
此外，利用单细胞分辨率的fLCM-seq（功能依赖的激光显微切割捕获后RNA测序技术），发现P2X3R在内脏痛相关PVH神经元中特异性高表达，通过PVH-LSV环路调节内脏痛；而VIPR2则在躯体痛相关PVH神经元中特异性高表达，通过PVH-ZIC环路调节躯体痛。
图1. PVH中内脏和躯体疼痛激活神经集群的表征
图2. 内脏和躯体疼痛激活的PVH神经群在转录水平上有显著差异
图3. P2X3R通过PVHP2X3R+-LSV神经环路特异性调节内脏疼痛，而VIPR2通过PVHVIPR2+-ZIC神经环路特异性调节躯体疼痛
（五）LCMomics：空间蛋白质组——人脑肿瘤的深层空间蛋白质组学研究[5]
研究背景：
组织中细胞蛋白表达谱的空间组织决定细胞功能，对理解疾病病理至关重要。空间蛋白质组学旨在解析组织空间背景下的分子表型，有助于了解药物作用、免疫系统活动等，推动疾病研究发展。
研究方法：
1.样本处理：从牛津脑库获取AT/RT肿瘤组织，经处理后切成10μm厚的切片，用于后续实验。
2.激光捕获显微切割：在三个长度尺度上进行，833μm分辨率下将肿瘤组织分为384个“体素”，350μm 分辨率下选取特定区域细分96个“体素”，40μm分辨率下对含血管区域细分。分别使用不同显微镜和参数切割组织样本。
3.蛋白质组样本处理：样本经解冻、消化等多步处理，使用不同方法处理不同分辨率样本，获取肽段用于后续分析。
4.LC-MS/MS分析：不同分辨率样本肽段采用不同仪器和参数进行液相色谱-质谱/质谱分析，以检测蛋白质。
5.数据分析：运用多种软件和方法对蛋白质组数据和空间数据进行分析，包括蛋白质鉴定、定量、聚类分析、通路分析等。
实验方案设计：
主要研究结果：
蛋白质组地形学：833μm分辨率下，确定组织面积与蛋白定量关系，鉴定出5321种蛋白质，绘制多种蛋白质的空间表达图谱；350μm分辨率下，在特定区域量化3994种蛋白质，验证了部分蛋白质表达模式；40μm分辨率下，对血管周围区域分析，量化1550种蛋白质，发现与血管相关的蛋白质表达模式。
空间蛋白质组学揭示组织异质性：通过聚类分析，在不同分辨率下确定了肿瘤不同区域的功能特征，如增殖、免疫反应、血管生成等相关特征，还发现了细胞外基质（ECM）和整合素受体的空间异质性。
图1 空间分辨蛋白质组学工作流程概述
图2 AT/RT肿瘤组织的空间蛋白质组学图揭示了区域边界
图3 聚类和功能分析显示了肿瘤微环境中833µm空间分辨率的区域AT/RT蛋白质组地图